Metoder för preparation av forskningsprover

Cellseparation med FicollPaque®
Benmärgsaspirat och perifert blod prepareras för att utvinna mononukleära leukocyter. Proverna gradientcentrifugeras med FicollPaque® en lösning som separerar celler beroende på cellernas densitet eller volymmassa.
Röda blodkroppar med hög densitet faller till botten av centrifugröret och mononukleära leukocyterna, de vita blodkropparna hamnar som ett vitt moln i mitten.
Efter att leukocyterna tvättats i en fosfatbuffert vitalfryses de i ett frysmedium som gör att cellerna inte skadas.
Andelen maligna, sjuka celler mäts med flödescytometri och anges i labdatasystemet.
Celler sparas i extremt låg temperatur -198°C i en kryofrys med flytande kväve. Celler kan hållas vitala, levande i många år utan att påverkas nämnvärt.

Serum

Serum centrifugeras och alikvoteras, delas upp i 1-4 alikvoter och förvaras i -80°C.

Likvor

Likvor centrifugeras och alikvoteras, delas upp i 1-4 alikvoter och förvaras i -80°C.

Extraktion av DNA och RNA

På Uppsala Biobank används en extraktionsrobot, QiaCube och metoden är Qiagen Allprep. Länk till protokoll

DNA och RNA extraheras från celler med hög halt av maligna, sjuka celler.

Utbyte av DNA och RNA alikvoteras, delas i volymer för att räcka till olika forskningsarbeten. DNA och RNA förvaras i -80°C.

Kvaliteten på RNA mäts på Qubit 4 och anges som RIN-värde i labdatasystemet.

Extraktion av konstitutionellt DNA

Det finns sparat helblod från patienter som ingår i studien ALLTogether (A2G) för att kunna extrahera konstitutionellt, medfött DNA.

Detta planeras att användas för helgenomsekvensering. Det kan användas för att utreda den genetiska bakgrunden hos cancerpatienter och för att se om prover från debut och recidiv skiljer sig åt.

 

Samtliga provtyper delas upp i delprover, alikvoter så att de räcker till flera olika analyser.

Cellpreparation med FicollPaque®

Cell separation

  • Bone marrow aspirate or peripheral blood collected in sodium-heparin tubes (might be EDTA).
  • Dilute with PBS depending on WBC and at least to double the volume of the sample.
  • Centrifuge the Ficoll tubes 30 min. 400g at room temperature.

Collect mononuclear cell fraction, dilute with PBS, centrifuge 10 min 400g at room temperature.

 Vital freezing of mononuclear cells         

    • Add 4-10 ml PBS and prepare a viable cell count (1:1 toluidinblue).
    • Calculate 500,000 cells for flow cytometry = Control % malignant cells. The result of FACS is noted in the Laboratory Information Monitoring System.
    • Centrifuge the rest of the cells 10 min 400g at room temperature.                   
    • The yield of mononuclear cells is distributed into 10 to 30 million cells per cryotube in freezing media(new borne calf serum+10% dimethyl sulfoxide).
    • Place tubes in CoolCell in -80°C freezer for at least 4 hours and at most 7 days.
    • Transfer to liquid nitrogen (-198°C) once a week.

FreezerPro, vårt labdatasystem

I NOPHO Leukemia biobank samlas all information om proverna i ett system som heter FreezerPro. Det är ett webbaserat provhanteringssystem som hjälper till att hålla ordning på provsamlingar och provrelaterad data.
Systemet är ett så kallat LIMS (Laboratory Information Management System) upphandlat av Uppsala Biobank för användning inom landstinget i Uppsala län och Uppsala universitet.
Mer information på Uppsala Biobank – FreezerPro (uu.se)

Bilden nedan visar hur systemet ser ut.